穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選實驗服務

穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選實驗服務

一、實驗目的

穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選實驗服務的主要目的是獲得能夠長期穩(wěn)定表達特定基因或干擾特定基因表達的細胞系，以便于長期觀察和檢驗基因?qū)毎δ芤约暗鞍紫嗷プ饔玫挠绊憽?/p>

二、實驗原理

通過將外源DNA/shRNA克隆到帶有某種抗性基因的載體上，重組載體轉(zhuǎn)染至宿主細胞并整合到其染色體中，并隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞。最后用載體中所含的抗性基因進行篩選，以獲得穩(wěn)定表達目標基因的細胞株。

三、實驗步驟

1. ?目標基因選擇?：

• 確定需要在細胞中穩(wěn)定表達的目標基因。

• 構(gòu)建質(zhì)粒，將目標基因與抗性基因結(jié)合。

2. ?載體選擇?：

• 使用能夠整合到宿主基因組中的載體，如慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。

• 質(zhì)粒載體也可用于實驗，但需要較高效的轉(zhuǎn)染方法和篩選策略。

3. ?轉(zhuǎn)染方法?：

• 根據(jù)細胞類型選擇適合的轉(zhuǎn)染方法，如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔等。

• 對于某些細胞，可能需要使用慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒感染。

4. ?優(yōu)化條件?：

• 優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，包括DNA濃度、細胞密度和轉(zhuǎn)染試劑用量，以提高轉(zhuǎn)染效率。

• 確定適合的MOI（感染復數(shù)），以確保高效的基因整合和表達。

5. ?篩選抗性基因?：

• 在轉(zhuǎn)染或感染后的24-48小時，添加選擇性抗生素或藥物（如G418、meifensuanzhi等），濃度需根據(jù)預先的滴定實驗確定。

• 篩選通常持續(xù)1-2周，直到未轉(zhuǎn)染的細胞被殺死，而轉(zhuǎn)染成功的細胞存活下來。

6. ?稀釋單克隆篩選?：

• 如果需要獲取單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)株，將篩選后的細胞進行極限稀釋，接種到96孔板中，每孔接種單個細胞。

• 待單細胞克隆長成小群體后，通過顯微鏡觀察并挑選生長良好的克隆進行進一步擴增。

7. ?驗證表達?：

• 提取篩選后細胞的RNA和蛋白，通過qRT-PCR和Western blot檢測目標基因的mRNA和蛋白表達水平。

• 如果目標基因帶有熒光標簽（如GFP），可以通過熒光顯微鏡直接觀察表達和定位。

• 使用PCR或Southern blot檢測目標基因是否整合到宿主基因組中。

8. ?細胞功能分析?：

• 根據(jù)研究目的，進行相關的功能實驗，如細胞增殖、凋亡、遷移等，驗證目標基因在穩(wěn)轉(zhuǎn)株中的生物學功能。

9. ?長期穩(wěn)定性檢測?：

• 持續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)株，定期檢測目標基因的表達水平，評估其在長期培養(yǎng)中的穩(wěn)定性。